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Blue Native PAGE（BN-PAGE）蓝色非变性PAGE是分离多亚基蛋白质复合物的一种特殊的非变性聚丙烯酰胺胶梯度电泳方法，其原理是使用温和的非离子型表面活性剂将蛋白质复合物与细胞膜分离，再用考马斯亮蓝G-250助溶并使蛋白质复合物带负电荷，在电泳时向阳极泳动，直到进入孔径直径跟自身直径相当的凝胶区域时停止。由于20～30%的蛋白是以膜蛋白复合体的形式存在并参与细胞活动，而BN-PAGE跟其他分离多亚基蛋白质复合物的技术（如排阻层析和密度梯度电泳）相比具有更高的分辨率，因此该技术正得到日益广泛的应用。为满足市场需求，本公司开发了BN-PAGE试剂盒。

• 一站式，用户用于不需要单独准备各种成分，不需要单独优化各种条件，即开即用，十分方便。
  
• 本试剂盒只提供T型上样液，它可溶解膜系蛋白复合体，跟BN-PAGE常用的其他表面活性剂兼容。
  
• 可以分离分子量在10～10000kDa之间的膜系蛋白复合体。也可用于分离可溶性蛋白复合体，但需自备透析试剂。
  
• BN-PAGE电泳后高丰度的蛋白复合体呈蓝色条带，可以直接肉眼观察。
  
• 切下的蓝色条带可以用于蛋白回收，也可以再第二维SDS- PAGE电泳，分离蛋白复合体的组成亚基。
  
• BN-PAGE胶跟后续的考染、银染、Western杂交或活性检测等操作兼容。

1. 本试剂盒不含样本制备相关试剂，但由于样本制备对BN-PAGE电泳非常重要，只有样品制备得到了完整的蛋白复合体，才有可能在BN-PAGE电泳胶上出现相应的条带。因此特别提醒用户在样本制备时需要使用跟BN-PAGE兼容的制备方法：
   
   • 制备膜系所用盐离子最好是钠盐和锂盐，不能使用钾盐和二价金属盐，因为它们可能会使本试剂盒提供的CCB染料或蛋白-CCB染料复合体沉淀。如果制备的样本已经含有高盐，必须先透析脱盐后才能用于本电泳试剂盒。
     
   • 不能使用任何可能使蛋白复合体解离的蛋白变性剂（如尿素，SDS）、还原剂（如DTT、β-巯基乙醇）、极端pH溶液。所用器皿也需要洗净这些残留的变性剂和还原剂。
     
   • 所有操作必须在4℃进行，避免加热和冻凝样本。
     
   • 酵母和细菌的细胞膜样品可能需要用DNase去除基因组DNA，否则粘稠的DNA会堵塞浓缩胶胶孔，使蛋白复合体根本进入不了凝胶。

2. 用跟BN-PAGE兼容的方法制备膜系样本沉淀（包括细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜等等），沉淀前用自备Lowry法试剂盒测定膜蛋白浓度，然后按每管400μg膜蛋白的量将样本分成很多小管，4℃离心沉淀（离心力和离心时间需要用户根据所研究的膜系选择，真核膜系和细菌膜系离心力可以差5倍），弃上清后得膜系样本沉淀。
   
3. 在膜系样本沉淀中加入本试剂盒提供的T型BN-PAGE上样液40μL，用移液枪头搅拌匀浆，然后加入适量20%去污剂溶液（动物线粒体膜加6μL，酵母线粒体膜加4.8μL，细菌细胞膜加4μL）。对于其他样本，加入20%去污剂溶液的最适量可以参考下表：
   

   样本类型	去污剂终浓度
   人全细胞裂解物	0.1%
   哺乳动物线粒体	1.0～2.4%
   植物线粒体	0.5%
   叶绿体	0.8%
   酵母过氧化物酶体	0.2～1.0%
   酵母微粒体	0.2～1.0%

4. 4℃放置60分钟溶解样品，每15分钟用枪头搅拌10秒助溶。
   
5. 保温结束后4℃离心10分钟收集上清。此步用以去除没有溶解的膜，离心力和离心时间需要用户根据所研究的膜系选择，真核膜系和细菌膜系离心力可以差5倍。
   
6. 在上清中加入5μL 50%甘油和适量的5% CBB溶液（动物线粒体膜加3μL，酵母线粒体膜加2.4μL，细菌细胞膜加2μL），对其他样本，加入CBB溶液的原则是0.5～1g CBB比1g膜蛋白，最适量可能需自行摸索。
   
7. 电泳时每孔上样10～20μL。

8. 首次使用本试剂盒时，需要按下述流程配制10%的APS（过硫酸铵）和丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液。
   
   • 新鲜配制10% APS：称量约0.1克过硫酸铵干粉到一个1.5mL塑料离心管中，按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL自备去离子水的比例将水加到管中，颠倒摇晃到过硫酸铵粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周，超过一周则不能再用。
     
   • 新鲜配制丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（T=49.5%，C=3%）：在装有丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的棕色塑料瓶中，加入146mL自备的去离子水，充分摇晃直到溶解（约需10～20分钟）。此溶液简称为AB溶液，最好在一个月内用完，4℃保存。
9. 根据所要分离的蛋白复合体的分子量大小按下表选择所需BN-PAGE胶的浓度范围。
   

   样本分子量范围	浓缩胶浓度	梯度分离胶浓度范围
   10～500kDa	4.0%	6%～18%
   10～1000kDa	4.0%	5%～13%
   10～3000kDa	3.5%	4%～13%
   10～10000kDa	3%	3%～13%

10. 下面以浓缩胶为3.5%、分离胶浓度为4%～13%的BN-PAGE为例说明制备两块0.16×14×14cm梯度胶的配制方法。如配制其他浓度的胶，各成分用量需按比例调整。如果电泳的目的是制备，则胶的厚度最好是0.3cm。
    
11. 先根据下表制备三种制胶液：
    

    成分	3.5%浓缩胶	4%母液	13%母液
    3×BN-PAGE配胶缓冲液	2mL	6mL	5mL
    AB溶液	0.44mL	1.5mL	3.9mL
    自备去离子水	3.4mL	10.4mL	3.0mL
    灌胶前加10% APS	50μL	100μL	75μL
    灌胶前加TEMED	5μL	10μL	7.5μL
    总体积	6mL	18mL	15mL

12. 根据梯度灌胶仪手册用4%母液和13%母液制备4%～13%的梯度胶，混合灌胶前才能加10%APS和TEMED。灌胶后胶上层需要盖上水以隔绝空气（氧气可以抑制聚合），水比胶轻，自然在上层。常温聚合30分钟。
    
13. 倒掉上层的水后再在已经凝固的梯度分离胶上灌入3.5%的浓缩胶，灌胶前才能加10%APS和TEMED，灌胶后立即插上样品梳。需要根据实验目的是分析还是制备选择相应类型的梳子。室温聚合30分钟。如果暂时不用，凝固的胶可在4℃放置1周。

14. 胶凝固后，将胶板固定到电泳架上，预冷6小时。低温容易使非共价聚合的蛋白复合体保持在聚合状态。
    
15. 往上槽和下槽中分别加入足够的预冷的1×BN-PAGE深蓝阴极电泳液（上槽）和1×预冷的BN-PAGE阳极电泳液（下槽）。上述两种电泳液均可用去离子水稀释本试剂盒提供的10×母液得到。
    
16. 小心拔出梳子后用槽中的深蓝阴级缓冲液吹加样孔。
    
17. 小心将溶解在BN-PAGE上样液中的样品上样。如果有自备的分子量标准，可以同时上样到最靠边的泳道。建议将一个等量的重复样品加热煮沸10分钟，离心后作为热解聚阴性对照上样。
    
18. 将电流设置在10 mA，电压设置在100V并开始电泳。
    
19. 等蓝色样品进入凝胶后（约需要10分钟）再将电流调到15 mA，电压调到500V继续电泳。
    
20. 当蓝色条带的前沿移动到胶长度的1/3位置的时候（约在调高电压后30分钟），关掉电源，吸出上槽的BN-PAGE深蓝阴极电泳液（此溶液可以4℃保存，再使用2～3次），加入BN-PAGE浅蓝阴极电泳液。打开电源，继续电泳。
    
21. 如果后续还要进行蛋白纯化、Western转膜、第二维电泳等需要蛋白移位的实验，则必须在所要蛋白复合体达到孔径直径跟自身直径相当的凝胶区域之前停止电泳，这样在后续处理时蛋白复合体才有移位的可能。具体电泳时间根据蛋白复合体分子量大小决定，可能需要1～2次预实验摸索。
    
22. 如果后续只是原位染色观察，则可以继续电泳，直到蛋白复合体移动到孔径直径跟自身直径相当的凝胶区域，不能再移动为止。一般需要3～6小时。由于在此凝胶区域的蛋白聚合体相当于被凝胶卡住，没法再移位，因此得到的BN-PAGE胶只能进行原位检测（如考染或银染），不能进行需要移位的检测（如蛋白回收、Western杂交等）。
    
23. 停止电泳，对BN-PAGE胶进行后续操作。本制品不含相关试剂。由于CBB染料会很快扩散，蛋白复合体条带也将很快变淡，因此需要快速进行需要颜色指导的操作（如切取BN-PAGE胶的条带等）。